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Na+K+- ATP酶活性測定說明書
更新時間:2019-10-22 點(diǎn)擊量:2254

Na+K+- ATP酶活性測定說明書(分光光度法)

貨號:YJ2218

規(guī)格:100管/48樣

產(chǎn)品簡介:

Na+K+- ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。

Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷,通過測定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性。

自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板跑、研缽、冰和蒸餾水。

產(chǎn)品內(nèi)容:

提取液:液體100mL×1 瓶,4保存。

試劑一:液體 10mL×1 瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1-20保存;臨用前加入6ml蒸餾水充分混勻待用;用不完的4保存一周。

試劑三:液體 2ml×1 瓶,4保存。

試劑四:粉劑×1瓶4保存。用時加入3mL蒸餾水4保存。

試劑五:粉劑×1 瓶,4保存。用時加入25ml蒸餾水,溶解后4保存一周。

試劑六:粉劑×1 瓶,4保存。用時加入25ml蒸餾水,溶解后4保存一周。

試劑七液體25ml×1,室溫保存。

試劑10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4保存。

0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:試劑八 20倍稀釋,即取 0.1mL試劑1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制:按H2O:試劑:試劑:試劑=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意:配試劑hao用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

樣品酶液的制備:

  • 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

  • 血清(漿)樣品:直接檢測。

操作步驟

  • 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至660nm,蒸餾水調(diào)零。
  • 酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)

 

對照管

測定管

試劑一(μL

65

45

試劑二(μL

60

60

試劑三(μL

40

20

樣本μL

40

100

混勻,37(哺乳動物)或25(其他物種)準(zhǔn)確水浴10min

試劑μL

25

25

μL

100

 

混勻,8000g,常溫離心10min,取上清液

  • 定磷(EP或96孔板中依次加入下列試劑)

 

空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

A

B

0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL

 

20

 

 

上清液(μL

 

 

20

20

蒸餾水(μL

20

 

 

 

定磷試劑(μL

200

200

200

200

混勻,室溫放置30min,在 660nm,記錄各管吸光值。

注意:

  • 由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒100管保證測48Na+K+-ATP酶。
  • 此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。
  • 空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計(jì)算 

  • 血清(漿)Na+K+- ATPase活力的計(jì)算:

定義:規(guī)定每小時每毫升血清(漿)中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/mL= C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷V÷T

=7.5×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

  • 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Na+K+- ATPase活力的計(jì)算:
  • 按蛋白濃度計(jì)算:

定義:規(guī)定每小時每毫克組織蛋白中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/mg)= C標(biāo)準(zhǔn)管×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V÷Cpr×V樣)÷T =7.5×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

  • 按樣本鮮重計(jì)算:

定義:規(guī)定每小時每克組織中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/g)= C標(biāo)準(zhǔn)管×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V÷(V÷V樣總×W)÷T=7.5×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

  • 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

定義:規(guī)定每小時每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/104)= C標(biāo)準(zhǔn)管×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V÷(V÷V樣總×500)÷T=0.015×A測定管-A對照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V總:酶促反應(yīng)總體積,0.25mLV樣:加入樣本體積,0.1mL ;V樣總:加入提取液體積,1mLT:反應(yīng)時間,1/6小時;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

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